Formation permanente Modélisation Moléculaire 20-22 et 27-29 Septembre 2004

• Etape 1: criblage des banques pour trouver des candidats structuraux
  

    Sur infobiogen,passez par SRS pour commencer votre recherche .

    Sélectionnez la base de données Swissprot et récuperez votre séquence.

   Ayant obtenu la séquence d'intérêt, vous allez rechercher une ou des séquences "proches", puis vous identifierez, parmi ces séquences homologues, la séquence dont la structure est connue.

         1- Vous pouvez aller sur le site de l'EBI pour lancer un BLAST2 sur la base de données Swissprot.

                Correction: cliquez ici pour visualiser le résultat du BLAST2 lancé sur Swissprot (visualisation avec Mview) .

        Commentez les résultats obtenus.

   Vous pouvez aussi procéder à un alignement multiple sur la totalité de ces séquences ou sur une sélection particulière de séquences.

                Correction: cliquez pour visualiser le résultat de l'alignement multiple construit à partir de toutes les séquences ou, construit uniquement à partir des séquences de canaux mécanosensibles.

        Commentez les résultats obtenus.

   Commentez les alignements et les scores obtenus.

         3- Compte tenu des conclusions faites sur l'homologie de séquences, vous auriez pu rechercher directement dans la PDB une structure de canal mécanosensible.

Recherchez cette structure et, récuperez son code pdb qui vous permettra d'y accéder plus rapidement pour de future recherche.

                Correction: cliquez ici pour visualiser le résultat de la requête dans la PDB.

    La structure cristallographique que vous venez de trouver correspond au MscL de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, dans la forme fermée du canal. En vous "promenant" dans le menu, vous aurez accès à plusieurs informations qui pourront vous être utiles pour la suite ( quels sont les résidus qui ont pu être résolus, quelle est la séquence primaire en acides aminés associée à la structure cristallographique, ...) ?

   Remarque : Nous avons recentré cette protéine par rapport à son axe principal. C'est ce fichier recentré, 1msl-center.pdb, que vous utiliserez dans la suite du TP. Visualisez ce pdb à l'aide de Rasmol et commentez.

        (c) Synthèse des données à utiliser :

Nous allons nous baser uniquement sur les positions atomiques des résidus résolus dans la structure cristallographique.

         1- Récuperez la séquence du MscL de M.tuberculosis.

        2. Modélisation automatique

         1- choix de la chaîne à modéliser

     Comme vous aurez pu le constater précedemment, le canal mécanosensible d'E.coli, tout comme celui de M.tuberculosis, est un homo-pentamère. Tous les monomères sont donc identiques au niveau de leur séquence en acides aminés, et leur agencement tridimensionnel est très proche ( vous pouvez vérifier en calculant le rmsd existant entre chaque monomère ). Pour ces diverses raisons, nous avons choisi de modéliser un des 5 monomères, dans une première étape. Puis dans une seconde étape, de répliquer le monomère construit par homologie, afin d'obtenir le pentamère complet.
Nous avons choisi de manière totalement arbitraire de modéliser le monomère A.

   Remarque : Les modèles construits par modélisation par homologie sont directement dépendants de la qualité de l'alignement utilisé. Nous testerons donc différents alignements entre nos 2 séquences, et observerons les conséquences quant aux différents modèles tridimensionnels obtenus.

         2- alignements testés

       3 types d'alignements vont être testés: le premier que vous aurez générer à partir du logiciel Modeller, le deuxième qui a été construit manuellement, et enfin le troisième obtenu avec des logiciels classiques d'analyse de séquence, ici le résultat de ClustalW sera utilisé.

Comme précédemment, vous devrez préparer vos fichiers .ali et .top nécessaires pour la construction des modèles.

        (a) alignement 1:

    En vous reportant au manuel, céez un fichier vous permettant de générer un alignement optimal entre vos 2 séquences, sachant que vous imposerez un coût pour créer une rupture ("gap") dans la séquence égal à -600, et un coût de -400 pour étendre ce gap.

                Correction: cliquez ici pour visualiser une solution acceptable du fichier pour effectuer l'alignement.
                Correction: cliquez ici pour vérifier l'alignement généré.

    Lancez le programme.

                Correction: cliquez ici pour visualiser une solution acceptable du fichier .ali pour le deuxième alignement.
                Correction: cliquez ici pour visualiser une solution acceptable du fichier .top nécessaire pour la simulation.

                Correction: cliquez ici pour visualiser les valeurs de la fonction objective associée à chaque modèle généré.

                Correction: Regardez les 3 modèles retenus (1, 2, 3) sur une simulation générant un nombre plus important de modèles.

                Correction: Après superposition des monomères, les différentes pentamères ont été reconstruits (modèle1, modèle2 et modèle3).

    Que pouvez-vous conclure, et quel est le meilleur modèle à retenir ?

    Nous allons passer à présent à l'application de contraintes structurales.

    En vous reportant au manuel, rajoutez dans votre fichier .top, les commandes nécessaires pour imposer une hélice alpha dans la partie cytoplasmique (résidus 100 à 112).

                Correction: cliquez ici pour visualiser une solution acceptable du fichier .top nécessaire pour imposer des contraintes structurales.

                Correction: cliquez ici pour visualiser les valeurs de la fonction objective associée à chaque modèle généré.

   Utilisez la même démarche que précédemment sur les 3 meilleurs modèles que vous pouvez récupérer ici: 1, 2, 3.

                Correction: Regardez les 3 modèles retenus.

                Correction: 3 meilleurs modèles complets (modèle1, modèle2 et modèle3).

    Que pouvez-vous conclure, et quel est le meilleur modèle à retenir ?

        (b) alignement 2:

    Pour visualiser l'alignement que vous aurez à utiliser, cliquez ici. Cet alignement a été établi à partir de données bibliographiques nombreuses sur le canal.

                Correction: cliquez ici pour voir une solution acceptable du fichier ali pour le deuxième alignement.
                Correction: cliquez ici pour voir une solution acceptable du fichier top nécessaire pour la simulation.

                Correction: cliquez ici pour visualiser les valeurs de la fonction objective associée à chaque modèle généré.

                Correction: Les 3 meilleurs modèles retenus ( 1, 2 et 3).

                Correction: 3 meilleurs modèles complets (modèle1, modèle2 et modèle3).

   Que pouvez-vous conclure, et quel est le meilleur modèle à retenir ?

        (c) alignement 3:

   Le dernier alignement que vous allez utiliser provient d'un résultat de ClustalW. Pour visualiser l'alignement, cliquez ici.

                Correction: cliquez ici pour voir une solution acceptable du fichier ali pour le troisième alignement.
                Correction: cliquez ici pour voir une solution acceptable du fichier top nécessaire pour la simulation.

                Correction: cliquez ici pour visualiser les valeurs de la fonction objective associée à chaque modèle généré.

                Correction: Les 3 meilleurs modèles retenus ( 1, 2 et 3).

                Correction: 3 meilleurs modèles complets (modèle1, modèle2 et modèle3).

    Que pouvez-vous conclure, et quel est le meilleur modèle à retenir ?

    Que pouvez-vous conclure, et quel est le meilleur modèle à retenir ?

        3. Validation des modèles

    Elle s'effectuera de la même manière que précédemment, avec Verify 3D et procheck en local.